單克隆抗體制備服務(wù)
 利用雜交瘤制備單克隆抗體通常操作流程為：抗原制備、用抗原免疫動(dòng)物、取免疫動(dòng)物的脾臟細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融      合成雜交瘤細(xì)胞、對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行篩選及克隆化、利用篩選得到的雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行單克隆抗體的大量生產(chǎn)。
 

抗原制備

用于制備單克隆抗體的抗原純度越高，單抗制備實(shí)驗(yàn)的成功率越高。一般來(lái)說(shuō)，抗原可以是蛋白（天然蛋白或重組蛋白）、多肽、小分子等。

免疫動(dòng)物
免疫動(dòng)物的選擇

通常，根據(jù)所用的骨髓瘤細(xì)胞可選用小鼠或大鼠作為免疫動(dòng)物。因?yàn)椋?nbsp;  所有的供雜交瘤技術(shù)用的小鼠骨髓瘤細(xì)胞系均來(lái)源于 BALB/c 小鼠，所有的大鼠骨髓瘤細(xì)胞都來(lái)源于 LOU/c 大鼠，所以一般的雜交瘤生產(chǎn)都是用這兩種純系動(dòng)物作為免疫動(dòng)物。就小鼠而言，一般選用 6-8 周齡雌性 Balb/c 小鼠。

制定免疫方案

免疫方案應(yīng)根據(jù)抗原的特性不同而定，選擇合適的免疫方案對(duì)于細(xì)胞融合雜交的成功，獲得高質(zhì)量的 McAb 至關(guān)重要。沒(méi)有一個(gè)免疫程序能適用于各種抗原，在設(shè)計(jì)免疫程序時(shí)，應(yīng)考慮到抗原的性質(zhì)和純度、抗原量、免疫途徑、      免疫次數(shù)與間隔時(shí)間、佐劑的應(yīng)用及動(dòng)物對(duì)該抗原的應(yīng)答能力等?，F(xiàn)用的免疫程序與多克隆抗體制備的方法類(lèi)似，      免疫途徑常用體內(nèi)免疫法包括皮下注射、腹腔或靜脈注射等。

表 1 列舉了目前常用的免疫程序:

                                                                      表 1：常見(jiàn)的免疫程序

免疫動(dòng)物
動(dòng)物的免疫一般在融合前前兩個(gè)月，根據(jù)確定的免疫方案開(kāi)始對(duì)動(dòng)物進(jìn)行初次免疫。動(dòng)物的免疫通常共有三次，在      初次免疫 2~3 周后進(jìn)行再次免疫，在再次免疫 3 周后進(jìn)行加強(qiáng)免疫（如果有需要的話）。一般來(lái)說(shuō)，在最后一次加強(qiáng)免疫后第 3 天取脾進(jìn)行融合較適宜。由不同抗原產(chǎn)生免疫反應(yīng)的能力也有強(qiáng)有弱，因此在注射抗原的同時(shí)，常常會(huì)加入佐劑，以增強(qiáng)抗原的抗原性，刺激機(jī)體產(chǎn)生較強(qiáng)的免疫反應(yīng)。

制備雜交瘤細(xì)胞
細(xì)胞融合前準(zhǔn)備
脾淋巴細(xì)胞制備

已經(jīng)免疫的 BALB/c 小鼠（或 LOU/c 大鼠），在無(wú)菌條件下去除脾臟，并完成脾淋巴細(xì)胞的制備。
 注意：制備脾淋巴細(xì)胞過(guò)程中，通常也會(huì)進(jìn)行小鼠眼球摘除采血的的操作，將血清分離后作為抗體檢測(cè)時(shí)陽(yáng)性對(duì)照血清。

骨髓瘤細(xì)胞制備

骨髓瘤細(xì)胞應(yīng)和免疫動(dòng)物屬于同一品系，這樣雜交瘤融合效率高，也便于接種雜交瘤在同一品系小鼠腹腔內(nèi)產(chǎn)生大量McAB。骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)可用一般的培養(yǎng)液，如RPMI1640，DMEM 培養(yǎng)基。小牛血清的濃度一般在10%~20%，細(xì)胞濃度以 104~105/ml 為宜，最大濃度不得超過(guò) 106/ml。當(dāng)細(xì)胞處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)的中期時(shí)，可按 1:3~1:10 的比例傳代。每 3~5 天傳代一次。細(xì)胞在傳代過(guò)程中，部分細(xì)胞可能有返祖現(xiàn)象，應(yīng)定期用 8-氮鳥(niǎo)嘌呤處理，使生存的細(xì)胞對(duì) HAT 呈均一的敏感性。
 

飼養(yǎng)細(xì)胞

在組織培養(yǎng)中，單個(gè)或少數(shù)分散的細(xì)胞不易生長(zhǎng)繁殖，若加入其它細(xì)胞，則可使這些細(xì)胞生長(zhǎng)繁殖，這種加入的細(xì)      胞稱(chēng)為飼養(yǎng)細(xì)胞。在細(xì)胞融合后選擇性培養(yǎng)過(guò)程中，由于大量骨髓瘤細(xì)胞和脾細(xì)胞相繼死亡，此時(shí)單個(gè)或少數(shù)分散      的雜交瘤細(xì)胞多半不易存活，通常必須加入飼養(yǎng)細(xì)胞使之繁殖。常用的飼養(yǎng)細(xì)胞有：小鼠腹腔細(xì)胞、小鼠脾臟細(xì)胞或胸腺細(xì)胞。

細(xì)胞融合
1） 進(jìn)行雜交瘤制備的具體操作方法有多種，這里介紹比較常用的一種，讀者如果有興趣可以在網(wǎng)上找其他的操作方法：將骨髓瘤細(xì)胞與脾細(xì)胞按 1:10 或 1:5 的比例混合在一起，在 50ml 離心管中用無(wú)血清不完全培養(yǎng)液洗 1 次， 離心，1200r/min 8 分鐘，棄去上清，用吸管吸凈殘留液體（為了避免影響 PEG 的濃度），輕輕彈擊離心管底，使細(xì)胞沉淀略松動(dòng)。
2）用吸管在 60s 內(nèi)（時(shí)間最好控制在 45s 左右）加預(yù)熱至 40℃的 50% PEG（PH 8.0） 1ml，邊加邊輕輕攪
拌。

3） 用 10ml 吸管在 90s 內(nèi)加 20-30ml 預(yù)熱的不完全培養(yǎng)基（終止 PEG 作用）；20-27℃靜置 10 分鐘。

4） 1000r/min 離心 6 分鐘，棄上清

5） 加入 5ml HAT 培養(yǎng)基，輕輕吹吸沉淀細(xì)胞，使其懸浮并混勻，然后補(bǔ)加含腹腔巨噬細(xì)胞的 HAT 培養(yǎng)基至80-100ml。

6） 分裝 96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板（孔板內(nèi)有飼養(yǎng)細(xì)胞層），每孔 0.1-0.15ml（或分裝 24 孔板，每孔 1.0-1.5ml）， 然后將培養(yǎng)板置 37℃，6% CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)。
7） 5 天后用 HAT 培養(yǎng)基換出 1/2 培養(yǎng)
      1. 7-10 天后用 HT 培養(yǎng)基換出 HAT 培養(yǎng)基；
      2. 經(jīng)常觀察雜交瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)情況，待其長(zhǎng)至孔底面積 1/10 以上時(shí)吸出上清供抗體檢測(cè)。說(shuō)明：上述步驟中，a~d 為 PEG 介導(dǎo)的細(xì)胞融合，e~i 為融合后的 HAT 篩選

融合細(xì)胞的篩選

脾細(xì)胞和骨髓瘤細(xì)胞經(jīng) PEG 處理后，形成多種細(xì)胞的混合體，只有脾細(xì)胞與骨髓細(xì)胞形成的雜交瘤細(xì)胞才有意義。在 HAT 選擇培養(yǎng)液中培養(yǎng)時(shí)，由于骨髓瘤細(xì)胞缺乏胸苷激酶或次黃嘌呤鳥(niǎo)嘌呤核糖轉(zhuǎn)移酶，故不能生長(zhǎng)繁殖，而雜交瘤細(xì)胞具有上述兩種酶，在 HAT 選擇培養(yǎng)液可以生長(zhǎng)繁殖。
 

雜交瘤細(xì)胞的克隆化
所謂克隆化是指使單個(gè)細(xì)胞無(wú)性繁殖而獲得該細(xì)胞團(tuán)體的整個(gè)培養(yǎng)過(guò)程。通常在得到針對(duì)預(yù)定抗原的雜交瘤以后需連續(xù)進(jìn)行 2-3 次克隆化，有時(shí)還需進(jìn)行多次?？寺』姆椒ê芏?，如有限稀釋法、軟瓊脂法、單細(xì)胞顯微操作法、單克隆細(xì)胞集團(tuán)顯微操作法和熒光激活細(xì)胞分類(lèi)儀（FACS）分離法。（相關(guān)閱讀：雜交瘤細(xì)胞亞克隆常用方法） 雜交瘤細(xì)胞克隆化的意義

從原始孔中得到的陽(yáng)性雜交瘤細(xì)胞，可能來(lái)源于二個(gè)或多個(gè)雜交瘤細(xì)胞，因此它們所分泌的抗體是不同質(zhì)的。為了得到完全同質(zhì)的單克隆抗體，必須對(duì)雜交瘤細(xì)胞進(jìn)行克隆化。另一方面，雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)的初期是不穩(wěn)定的，有的細(xì)胞丟失部分染色體，可能喪失產(chǎn)生抗體的能力。為了除去這部分已經(jīng)不再分泌抗體的細(xì)胞，得到分泌抗體穩(wěn)定的單克隆雜交瘤細(xì)胞系，也需要克隆化。另外，長(zhǎng)期液氮凍存的雜交瘤細(xì)胞，復(fù)蘇后其分泌抗體的功能仍有可能丟失，      因此也應(yīng)作克隆化，以檢測(cè)抗體分泌情況。

雜交瘤細(xì)胞的凍存
雜交瘤細(xì)胞制備單克隆抗體的過(guò)程中，通常將一部分雜交瘤細(xì)胞凍存起來(lái)備用，便于以后大規(guī)模生產(chǎn)單克隆抗體以      及避免外部不可測(cè)的影響因素對(duì)實(shí)驗(yàn)帶來(lái)過(guò)大的影響。

利用雜交瘤細(xì)胞大規(guī)模生產(chǎn)單抗
利用雜交瘤細(xì)胞大量制備單克隆目前主要有兩種方法，一種是動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)法，另外一種是體外培養(yǎng)法。

動(dòng)物體內(nèi)生產(chǎn)單抗的方法
鑒于絕大多數(shù)動(dòng)物用雜交瘤均由 BALB/c 小鼠（或 LOU/c 大鼠）的骨髓瘤細(xì)胞與同品系的脾細(xì)胞融合而得，因此使用的動(dòng)物首選 BALB/c 小鼠（或 LOU/c 大鼠）。將雜交瘤細(xì)胞接種于小鼠腹腔內(nèi)，在小鼠腹腔內(nèi)生長(zhǎng)雜交瘤， 并產(chǎn)生腹水，可得到大量的腹水單抗。該法操作簡(jiǎn)便、經(jīng)濟(jì)且抗體濃度很高。但是，腹水中?；煊行∈蟮母鞣N雜蛋      白（包括 Ig），因此得到的腹水抗體要提純后才能使用。

體外培養(yǎng)法
體外培養(yǎng)可以采用單層細(xì)胞培養(yǎng)的形式，也可以采用懸浮培養(yǎng)的形式。細(xì)胞體外培養(yǎng)一定時(shí)間后，收集培養(yǎng)上清液，      離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆?？贵w相較于免疫動(dòng)物生產(chǎn)單克隆抗體的方法，體外培養(yǎng)不需要對(duì)得到的抗體進(jìn)行純化，但該法的產(chǎn)量較低且費(fèi)用昂貴。

抗體的檢測(cè)
檢測(cè)抗體的方法有多種，根據(jù)抗體類(lèi)型的不同，可以選擇不同的篩選方法，一般以快速、簡(jiǎn)便、特異、敏感的方法      為優(yōu)先。其中最常用的為酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）法。

ELISA 的原理為：將使抗原（或抗體）結(jié)合到某種固相載體表面，使抗體（或抗原）與某種酶連接成酶標(biāo)抗體（或抗原），將待測(cè)抗體與酶標(biāo)抗體（或抗原）按不同的步驟與固相載體表面的抗原（或抗體）起反應(yīng)。最終結(jié)合在固      相載體的酶標(biāo)抗體量與待檢測(cè)抗體的量呈一定比例。加入酶反應(yīng)底物，底物被酶催化顯色，根據(jù)顏色的深淺便進(jìn)行      定性或定量分析。

其它常用的方法有:
放射免疫測(cè)定（RIA） 可用于可溶性抗原、細(xì)胞 McAb 的檢測(cè)。免疫熒光試驗(yàn) 適合于細(xì)胞表面抗原的 McAb 的檢測(cè)。
其它檢測(cè)方法如間接血凝試驗(yàn)、細(xì)胞毒性試驗(yàn)、旋轉(zhuǎn)粘附雙層吸附試驗(yàn)等。