產(chǎn)品英文名（Product Name）

FITC Annexin V/PI Apoptosis Detection Kit

產(chǎn)品描述（Description）

細胞凋亡是胚胎發(fā)育和為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細胞自主的有序的死亡的一種正常生理過程。它是細胞正常生理活動的一部分，包括細胞膜不對稱性和附著性喪失、細胞質(zhì)和核質(zhì)濃縮、核小體間DNA斷裂。細胞膜的破壞是細胞凋亡的早期特征。在正常細胞中，磷酯酰絲氨酸（PS）只分布在細胞膜脂質(zhì)雙層的內(nèi)側，而在細胞凋亡的早期，細胞膜中的磷酯酰絲氨酸（PS）由質(zhì)膜內(nèi)側翻向外側，從而將PS暴露于細胞外部環(huán)境。Annexin V是一種35-36KD的Ca2+依賴性磷脂結合蛋白，與PS具有高度親和力，故可通過細胞外側暴露的PS與凋亡早期細胞的細胞膜結合。因此，Annexin V被公認為檢測細胞早期凋亡的靈敏指標之一。

碘化丙啶（Propidium， PI）是一種核酸染料，PI不能透過正常細胞或早期凋亡細胞的完整細胞膜，但可穿透膜損傷的細胞如晚期凋亡細胞或壞死細胞的細胞膜并與其內(nèi)的DNA結合，使細胞核著染上紅色。因此，將Annexin V與PI共染，則可以區(qū)分不同凋亡時期的細胞。本公司生產(chǎn)的細胞凋亡試劑盒將Annexin V以綠色熒光FITC進行標記，標記后的Annexin V保留了與PS的高親和力，可作為探針，利用熒光顯微鏡或流式細胞儀進行細胞早期凋亡檢測。聯(lián)合可檢測細胞晚期凋亡或死細胞的紅色核酸染料PI則可以很好的將處于不同凋亡時期的細胞核死細胞區(qū)分開來。在雙色流式細胞散點圖上，Annexin V-FITC與PI雙陰性為正常細胞群，Annexin V-FITC陽性、PI陰性為早期凋亡細胞群，Annexin V-FITC與PI雙陽性為晚期凋亡細胞或壞死細胞群。

儲存條件（Storage）

2-8℃避光保存

運輸方式（Shipping）

冰袋運輸

使用方法（Standard Operating Procedure）icon

1.實驗前準備

（1）1x磷酸緩沖液PBS；

（2）凋亡誘導劑；

（3）去離子水；

2.樣品預處理

2.1 樣品染色

（1）根據(jù)實驗要求誘導細胞凋亡。檢測樣品中應包含未經(jīng)處理的細胞樣品，作為陰性對照。此外，進行流式檢測時需取實驗組分別進行Annexin V-FITC和PI單染，用于調(diào)節(jié)補償；

（2）收集細胞。

  懸浮細胞：1000rpm、4℃離心5min，棄培養(yǎng)基上清；

  貼壁細胞：用不含EDTA的胰酶消化細胞，終止消化后收集，1000rpm、4℃離心5min，棄上清；

（3）洗滌細胞。用預冷的PBS洗滌細胞2次，每次均在1000rpm、4℃離心5min，棄上清；

（4）配制1x Annexin V-binding buffer。用去離子水按照1:5體積比稀釋5xAnnexin V-binding buffer備用；

（5）細胞重懸。加入100 μl 1x Annexin V-binding buffer，輕輕吹勻至單細胞懸液；

（6）細胞染色。加入5 μl Annexin V和5 μl PI Staining Solution，輕輕吹勻，置于室溫避光孵育5-10min，再加入400 μl 1x Annexin V-binding buffer，輕輕混勻重懸。在1h內(nèi)上流式細胞儀進行檢測分析或熒光顯微鏡觀察分析。 

2.2 樣品分析

2.2.1 熒光顯微鏡分析

（1）將已染色重懸的細胞滴一滴在載破片上，并用蓋破片蓋上細胞；

  針對貼壁細胞可以直接接爬片讓細胞直接生長在爬片上進行誘導及染色處理；

（2）置于熒光顯微鏡下用雙色濾光片觀察：Annexin-V-FITC熒光信號呈綠色，PI熒光信號呈紅色。

2.2.2 流式細胞儀分析

（1）流式細胞儀檢測激發(fā)波長488nm，F(xiàn)ITC的綠色熒光采集通道FL1通道檢測；PI的紅色熒光采集通道PI通道或FL2或FL3通道檢測，建議使用FL3通道，每個樣本采集10000個事件；

（2）熒光補償調(diào)節(jié)。使用未經(jīng)凋亡誘導處理的正常細胞，作為對照進行熒光補償調(diào)節(jié)去除廣譜重疊與設定十字門的位置。在雙色流式細胞散點圖上，Annexin V-FITC與PI雙陰性為正常細胞群，Annexin V-FITC陽性、PI陰性為早期凋亡細胞群，Annexin V-FITC與PI雙陽性為晚期凋亡細胞或壞死細胞群。

3. 應用案例（流式細胞術檢測喜樹堿誘導Jurakt細胞凋亡）

分別用2.0、10 μM喜樹堿（Camptothecin， CPT）誘導Jurkat細胞（人T淋巴瘤細胞株）4h收集細胞進行流式凋亡檢測。參照產(chǎn)品說明書進行相關染色操作并用流式細胞儀進行凋亡檢測，結果如下圖。

（A）0μM對照組. （B）2.0μM實驗組. （C）10μM實驗組. 其中

產(chǎn)品實驗圖片icon

組分&說明（Component & Instruction）icon