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CETSA技術(shù)在細胞與組織裂解液水平研究中的應(yīng)用與進展

2025-02-08 點擊數(shù):0 分享至:

引言


在生命科學研究里,新技術(shù)不斷刷新我們對生物分子的認知。細胞熱位移分析(CETSA)作為新興生物物理技術(shù),為蛋白質(zhì)研究開辟新路徑。傳統(tǒng)方法研究蛋白質(zhì) - 配體相互作用及蛋白質(zhì)穩(wěn)定性時,操作復(fù)雜、需特殊標記,還會干擾蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)功能和細胞生理環(huán)境,導(dǎo)致結(jié)果準確性和可靠性欠佳。CETSA技術(shù)利用蛋白質(zhì)受熱變性特性,在接近細胞生理狀態(tài)下監(jiān)測細胞或組織裂解液中蛋白質(zhì)狀態(tài),具有簡單、快速、無需標記、不破壞生理環(huán)境的優(yōu)勢,在蛋白質(zhì)組學研究中備受青睞。


CETSA技術(shù)原理


(一)基本原理

CETSA技術(shù)基于蛋白質(zhì)對溫度變化的響應(yīng)。正常時,蛋白質(zhì)靠獨特三維結(jié)構(gòu)維持溶解性和穩(wěn)定性以執(zhí)行功能。與配體結(jié)合后,內(nèi)部結(jié)構(gòu)穩(wěn)定性改變,影響熱穩(wěn)定性。實驗時,將細胞或組織裂解液置于溫度梯度處理,用蛋白質(zhì)免疫印跡(WB)、質(zhì)譜(MS)分析蛋白質(zhì)溶解度或豐度變化,繪制熔解曲線。蛋白質(zhì)與配體結(jié)合會使熔解曲線位移,科研人員借此了解蛋白質(zhì) - 配體相互作用。


(二)技術(shù)流程

樣品制備:細胞水平研究收集對數(shù)生長期細胞,PBS洗滌后用物理或化學方法制備裂解液;組織水平研究將新鮮組織切碎,緩沖液勻漿后裂解。


溫度梯度處理:將裂解液均分,從37℃起以2 - 5℃間隔升溫至95℃左右,各溫度點孵育5 - 15分鐘。


蛋白質(zhì)分離與檢測:孵育后冰浴冷卻,離心分離變性和未變性蛋白質(zhì)。WB技術(shù)通過電泳、轉(zhuǎn)膜、抗體檢測目標蛋白質(zhì)豐度;MS技術(shù)酶解蛋白質(zhì)成肽段,用液相色譜 - 質(zhì)譜聯(lián)用儀分析鑒定和定量。


CETSA技術(shù)在細胞水平的應(yīng)用


藥物靶點驗證:

藥物研發(fā)中鎖定靶點很關(guān)鍵,CETSA技術(shù)檢測藥物處理后細胞蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性變化,可驗證潛在靶點。以抗癌藥研究為例,分析癌細胞中相關(guān)蛋白質(zhì),熔解曲線有位移且符合預(yù)期機制的可能是靶點,能在全細胞蛋白質(zhì)組篩選新靶點。


研究蛋白質(zhì) - 蛋白質(zhì)相互作用:

細胞生物學過程多依賴蛋白質(zhì)相互作用,CETSA技術(shù)通過比較單個和復(fù)合蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性判斷其相互作用及強弱,可用于研究信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。


監(jiān)測細胞生理狀態(tài)變化:

細胞不同生理狀態(tài)下蛋白質(zhì)組有變化,CETSA技術(shù)能捕捉這些變化。如細胞氧化應(yīng)激時,檢測抗氧化蛋白質(zhì)熔解曲線可了解其應(yīng)激狀態(tài)。


CETSA技術(shù)在組織裂解液水平的應(yīng)用


疾病診斷與生物標志物發(fā)現(xiàn):

臨床研究中,CETSA技術(shù)用于組織裂解液,對比正常和病變組織蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性差異,篩選生物標志物,如腫瘤組織中熱穩(wěn)定性不同的蛋白質(zhì)可用于腫瘤診斷。


藥物療效評估:

分析藥物處理后的組織裂解液蛋白質(zhì)變化,可直觀反映藥物療效。如神經(jīng)系統(tǒng)疾病藥物研究,觀察腦組織裂解液中神經(jīng)功能相關(guān)蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性,判斷藥物作用。


組織特異性蛋白質(zhì)研究:

不同組織蛋白質(zhì)表達譜和功能不同,CETSA技術(shù)對比不同組織裂解液蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性,可發(fā)現(xiàn)特定組織高表達且熱穩(wěn)定性獨特的蛋白質(zhì),有助于揭示組織生物學特性。


CETSA技術(shù)的優(yōu)勢與局限性


優(yōu)勢

生理相關(guān)性:接近生理條件檢測,還原蛋白質(zhì)狀態(tài)和相互作用,避免干擾,保證結(jié)果真實可靠。


無標記檢測:無需復(fù)雜標記,減少步驟和干擾,降低成本,提高效率。


高通量潛力:與質(zhì)譜結(jié)合可一次分析大量蛋白質(zhì),實現(xiàn)蛋白質(zhì)組系統(tǒng)性研究。


CETSA技術(shù)在多領(lǐng)域已展現(xiàn)應(yīng)用前景,優(yōu)化實驗和分析方法、克服局限性是其發(fā)展關(guān)鍵。隨著質(zhì)譜和生物信息學進步,有望實現(xiàn)更精準蛋白質(zhì)組分析,與其他前沿技術(shù)結(jié)合也將拓展其應(yīng)用邊界。


研錦生物可以利用基于靶點或小分子結(jié)構(gòu)的藥物設(shè)計方法,對可購買化合物、天然產(chǎn)物等數(shù)據(jù)庫進行虛擬篩選,并獲得潛在活性的化合物列表供進一步活性實驗確證。面向制藥企業(yè)和科研院所,可提供一站式的早期藥物研發(fā)服務(wù),包括虛擬藥物篩選、先導(dǎo)優(yōu)化、靶標預(yù)測、 動力學模擬等,涉及小分子化學藥、生物藥、中藥等多種新藥類型,為您提供優(yōu)質(zhì)的藥物發(fā)現(xiàn)服務(wù)